Nitrate test de réduction – gonorrhée …

Nitrate test de réduction - gonorrhée ...

Nitrate test de réduction

Chez les humains Neisseria et les espèces apparentées, trois espèces – N. mucosa. M. catarrhalis. et K. denitrificans réduire les nitrates. Le test de réduction des nitrates est un test critique pour différencier les N. gonorrhoeae et K. denitrificans. En particulier, lorsque des souches de K. denitrificans semblent être diplocoques Gram négatif dans les frottis colorés.

Principe

Les espèces bactériennes peuvent être différenciées sur la base de leur capacité à réduire les nitrates en nitrites ou de gaz azoté. Parmi les Neisseriaceae d’origine humaine, des souches de Neisseria mucosa. Moraxella catarrhalis. et denitrificans Kingella réduire les nitrates. souches de M. catarrhalis et K. denitrificans ont été mal identifiés comme N. gonorrhoeae. Le test de réduction des nitrates permet une différenciation entre ces espèces qui sont le nitrate positif et N. gonorrhoeae (Nitrate-négatif). La réduction des nitrates peut être couplé à la respiration anaérobie chez certaines espèces.

La voie biochimique impliquée dans la réduction des nitrates est représentée sur la figure 1. Le nitrate est réduit en nitrite qui peut ensuite être réduit en oxyde nitrique, l’oxyde nitreux ou de l’azote (figure 1).

Figure l. voie de réduction Nitrate.

Le test de la réduction du nitrate est basée sur la détection de nitrite dans le milieu après incubation avec un organisme. Si elle est présente dans le milieu, le nitrite réagit avec l’acide sulfanilique (Nitrate réactif A) pour former un complexe incolore (acide sulfanilique nitrite). Ce complexe sera alors obtenir un précipité rouge (prontosil) lorsque le réactif de nitrate B (alpha-naphtylamine) est ensuite ajouté à l’essai comme le montre la figure 2.

Figure 2. représentation schématique de la détection de nitrite dans le milieu.

Une couleur rouge sera produite dans le milieu que lorsque le nitrite est présent dans le milieu. L’absence d’une couleur rouge dans le milieu après l’addition d’acide sulfanilique et d’alpha-naphtylamine signifie seulement que le nitrite ne sont pas présentes dans le milieu. Il peut y avoir deux explications à cette observation.

  • Le nitrate peut ne pas avoir été réduit; la souche est le nitrate négatif.
  • Le nitrate peut avoir été réduit en nitrite qui a ensuite été complètement réduit en oxyde nitrique, l’oxyde nitreux ou de l’azote, qui ne réagit pas avec les réactifs qui réagissent avec du nitrite; la souche est le nitrate positif.

Tout milieu de test qui donne un résultat négatif après l’addition des réactifs à base de nitrate doit encore être testé afin de déterminer laquelle des deux interprétations sont exactes.

Un test de réduction des nitrates réussie dépend de la réalisation du test dans les conditions correctes.

  1. La réaction se produit le mieux si le support de base supporte la croissance de l’organisme. Cependant, bien que certaines Neisseria espèces ne poussent pas bien dans les milieux de bouillon, le test de réduction des nitrates peut être réalisée avec succès dans un milieu qui ne supporte pas la croissance en inoculant le milieu fortement pour fournir une enzyme préformée suffisante pour que la réaction se produit.
  2. la réaction du nitrate ne se produit que dans des conditions anaérobies. Le milieu contenant du nitrate est distribué dans des tubes pour donner une faible surface spécifique: rapport de profondeur qui limite la diffusion d’oxygène dans le milieu, par exemple 5 ml de milieu est distribué dans un tube de 13 mm de diamètre. Neisseria et les espèces apparentées utilisent l’oxygène dans le milieu et produisent rapidement des conditions anaérobies qui sont idéales pour la réduction du nitrate de se produire.

Le test de la réduction des nitrates est effectuée dans un milieu contenant 0,2% de nitrate de potassium. Le milieu est inoculé fortement avec une culture pure de l’organisme recherché et mis à incuber à 35 ° C pendant 48 à 36.5C h. dans un incubateur avec ou sans dioxyde de carbone supplémentaire.

Réduction des nitrates est détectée avec les réactifs de Griess Llosvay, l’acide sulfanilique et l’alpha-naphtylamine. l’acide sulfanilique (Nitrate réactif A) est ajouté au mélange d’incubation et forme un complexe (nitrite-acide sulfanilique) avec un nitrite présent dans le milieu. Lors de l’alpha-naphtylamine (Nitrate réactif B) est ajouté au milieu incubé, un précipité rouge (prontosil) sera formé avec un nitrite sulfanilique complexe d’acide présent dans le milieu.

Un organisme peut être signalé comme nitrate positif si une couleur rouge se développe dans le milieu après réactifs Nitrate A et B sont ajoutés au milieu. ce qui indique que l’organisme a réduit le nitrate en nitrite.

L’absence d’une couleur rouge après l’addition des deux réactifs ne signifie pas automatiquement que l’organisme est incapable de réduire les nitrates. Les souches peuvent avoir réduit le nitrate en nitrite, puis réduit le nitrite complètement aux gaz azotés qui ne sont pas détectées lorsque les réactifs Nitrate A et B sont ajoutés au milieu. Si le milieu ne change pas de couleur après l’addition d’acide sulfanilique et d’alpha-naphtylamine, une petite quantité ("la pointe du couteau") De poussière de zinc est ajoutée au milieu incubé. La poussière de zinc va catalyser la réduction du nitrate en nitrite par voie chimique. Ainsi, si le nitrate n’a pas été réduite par les organismes, à savoir qu’ils sont des nitrates négative, elle sera réduite par la poussière de zinc et une couleur rouge se développer dans le milieu incubé à 15 min. Si aucune couleur ne se développe dans le milieu incubé, après addition de poussière de zinc, les organismes ont non seulement réduit le nitrate en nitrite, mais ont réduit le nitrite aux gaz azotés; ces organismes sont également nitrate positif.

Bien que le nitrate moyen est fourni avec des tubes de Durham pour détecter la production de gaz, la production de gaz ne sont pas enregistrées pour Neisseria espèce. Bien que certaines espèces peuvent réduire les nitrates au-delà de nitrite aux gaz azotés, le gaz ne peut accumuler dans le tube. L’accumulation du gaz dépend de la vitesse à laquelle elle est produite. Lorsque le gaz est produit très lentement, il peut se dissoudre dans le milieu et ne pas accumuler dans le tube de Durham.

Conditions des prélèvements

spécimen Optimum: Une culture pure de, un diplococcus gramme suspect négatif oxydase positive (Neisseria spp. ou M. catarrhalis ) Sur gélose chocolat incubée en atmosphère enrichie en dioxyde de carbone à 35 ° C à 36.5C pendant 18 à 24 heures.

spécimen Inacceptable: Cultures d’isolats sur gélose chocolat incubés dans un carbone Dioxyde atmosphère enrichie à 35 ° C à 36.5C pendant plus de 24 h.

facteurs qui influent sur les résultats des tests Compromettre:

  • Milieu d’essai doit être inoculée assez fortement pour permettre la réaction de se produire avec des enzymes préformées. inoculum insuffisante ne peut pas permettre à des organismes d’utiliser l’oxygène pour produire des conditions anaérobies dans lesquelles la réduction des nitrates peut se produire.
  • Trop de poussière ajouté au tube incubée de zinc peut se traduire par une réduction très rapide au-delà de nitrate nitrite de gaz azoté pour que le nitrite n’a pas été détecté.

Stabilité de l’échantillon: La détection de la réduction des nitrates pour Neisseria et les espèces apparentées dépendent de la présence d’enzymes préformées.

  • Les tests ne doivent être effectuées avec inoculum récoltées à partir de 24 h cultures.
  • moyen Nitrate devrait être inoculé dans les 30 minutes. d’éliminer la culture de l’incubateur; l’exposition prolongée de la culture à la température ambiante peut conduire à une activité enzymatique réduite.

Moyen / Réactifs

Moyen: bouillon Nitrate (bouillon d’infusion de coeur contenant 0,2% de nitrate de potassium)

bouillon d’infusion de coeur (Difco), 25,0 g
Le nitrate de potassium, 2,0 g
L’eau distillée, 1000.0 ml

  1. Dissoudre les ingrédients dans l’eau distillée; ajuster la solution à pH 7,0.
  2. Distribuer 5 ml aliquotes du bouillon dans 16 mm x 100 mm tubes avec inserts de gaz (tubes Durham, 6 mm x 50 mm).
  3. Autoclave pendant 15 min à 121 ° C.

moyen de magasin à 4 ° C à 10 ° C (au réfrigérateur) jusqu’à leur utilisation. Préchauffer le milieu à la température ambiante avant l’inoculation.

Réactifs:une solution d’acide sulfanilique (Nitrate réactif A): 0,8% dans l’acide acétique 5N
Nom chimique: 4-aminobenzène acide sulfonique
Magasin Nitrate réactif A à 15C à 30C (température ambiante) pendant 3 mois, dans l’obscurité. Les réactifs peuvent être stockés dans des récipients en verre brun foncé; bouteilles peuvent être enveloppés dans une feuille d’aluminium pour assurer l’obscurité.

Alpha-Naphthylamine solution (réactif Nitrate B): 0,6% dans l’acide acétique 5N
Nom chimique: N, N-diméthyl-1 naphtylamine
Magasin réactif Nitrate B à 2C à 8C (réfrigéré) pour un maximum de 3 mois, dans l’obscurité. Les réactifs peuvent être stockés dans des récipients en verre brun foncé; bouteilles peuvent être enveloppés dans une feuille d’aluminium pour assurer l’obscurité.

La poudre de zinc, qualité réactif: Conserver à température ambiante (15C à 30C)

Attention: L’acide acétique est corrosif. Le contact avec la peau peut provoquer des cloques et des brûlures. En cas de contact, rincer les yeux et la peau immédiatement et abondamment avec de l’eau (pendant au moins 15 min.)

Contrôle de la qualité / Procédure d’essai

souches QC:

  • Nitrate réductase-contrôle positif: denitrificans Kingella. CDC 10236
  • Nitrate réductase-contrôle négatif: Neisseria gonorrhoeae. ATCC 43069

QC souches sont conservées à -70 ° C dans une solution de bouillon de trypticase soja contenant 20% de glycérol. Les réactions des souches de contrôle doivent être confirmés au moment des stocks congelés sont préparés. souches QC peuvent être stockés à -70 ° C pendant jusqu’à 2 ans.

QC souches sont testées de la même manière que les isolats cliniques. souches QC doivent être repiquées au moins une fois après la culture initiale de l’échantillon congelé avant que le test est effectué. Les isolats cliniques peuvent être repiquées à partir du milieu sélectif ou subcultures purifiées. Veiller à ce que les cultures sont pures.

  1. Décongeler flacons de souches de contrôle stockés à -70 ° C.
  2. Streak sur des plaques de gélose chocolat ou gélose GC complété pour l’isolement. Incuber à 35 ° C pour 36.5C dans une atmosphère enrichie en dioxyde de carbone pendant 18 à 24 heures.

Avec un coton-tige stérile, préparer une suspension dense de colonies bien isolées à partir d’une culture pure de l’isolat mis à incuber sur un milieu de chocolat à 35 ° C 36,5 C dans une atmosphère enrichie en dioxyde de carbone pendant 18 à 24 h. Inoculer milieu d’essai pour donner la turbidité lourde.

Remarque: souches de N. gonorrhoeae et l ‘autre Neisseria spp. ne peuvent pas croître dans ce milieu. Ainsi, la réaction peut dépendre de l’enzyme préformée.
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  • Incuber milieux inoculés et un contrôle moyen tube de milieu non ensemencé à 35 ° C à 36,5 C dans une atmosphère de dioxyde de carbone enrichi pendant 48 h.
  • Au bout de 48 heures. ajouter une incubation avec des pipettes Pasteur, 5 gouttes de réactif #A, suivi par 5 gouttes de réactif #B à chaque tube. Agiter le tube bien mélanger les réactifs avec le milieu.

    Examiner la suspension pour une couleur rose-rouge qui devrait se développer dans quelques minutes si le milieu est encore chaud. La réaction peut prendre un peu plus si le milieu est froid lorsque les réactifs sont ajoutés.

    Si la suspension vire au rose-rouge avant l’ajout de poudre de Zn, le recation est positif et le test est terminé. Ne pas effectuer l’étape 4.

    Les réactions observées avec le témoin non inoculé moyen et le nitrate négatif, et les isolats de nitrate positifs sont illustrés à la figure 3. La figure 4 et la figure 5. respectivement.
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    Si la suspension est incolore après l’addition des réactifs A et B, ajouter une petite quantité (4 à 5 mg; "point de couteau") De poudre de zinc dans le milieu. Agiter vigoureusement le tube et laisser reposer à température ambiante pendant 10-15 min.

    Si le milieu reste incolore après l’addition de poudre de Zn, le résultat du test est positif.
    Si le milieu devient rose après addition de poudre de Zn, le résultat est négatif.
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    La figure 3. Réaction observée avec non inoculés Nitrate Medium.

    La figure 5. Réactions observées avec les espèces Nitrate-positives.

    Contrôle Horaire Qualité:

    • Un essai QC nitrate réductase est réalisée chaque jour des isolats cliniques sont testés.
    • Problèmes & Solutions

      Le test de réduction des nitrates peut donner des résultats faussement négatifs ou faussement positifs si le milieu ne se produit pas avec précision ou le test est pas effectué avec précision. La réaction dans ce test dépend d’un certain nombre de facteurs.

      • La non-détection de couleur rose dans le tube de milieu témoin non inoculé après l’addition de poudre de Zn peut être due (1) dans le milieu ne contenant pas de nitrate ou (2) l’addition d’une trop grande poussière de zinc qui catalyse la réduction du nitrate au-delà du nitrite aux gaz azoté. La solution la plus simple est d’obtenir plus de nitrate moyen assurant que le nitrate a été ajoutée au milieu de base. Alternativement, ensemencer le milieu avec une souche de contrôle positif, mais le test pour une réaction après un temps d’incubation plus courte; souches de N. mucosa va produire une réaction de nitrite positif après une incubation de quelques heures. Si le milieu est confirmé pour contenir le nitrate, répéter le test jusqu’à ce que vous avez déterminé le montant exact de la poussière de zinc à ajouter. Il est essentiel d’apprendre la quantité de poussière de zinc pour ajouter à l’épreuve. Ajout de trop de poussière de zinc peut entraîner un résultat faussement positif.
      • Si une couleur rose est détectée dans le milieu témoin non ensemencé après réactifs de nitrate A et B ont été ajoutés au milieu, le milieu est contaminé avec du nitrite. La seule solution est d’obtenir un nouveau lot de milieu qui ne soit pas contaminé par du nitrite.
      • Dans un milieu contenant du nitrate, l’échec de la souche témoin positive, denitrificans Kingella. pour donner une réaction positive se produirait seulement si la souche est pas K. denitrificans. Vérifier l’identité de la souche témoin positive. Sélectionnez une nouvelle culture de la souche témoin et répéter le test. De même, si un test positif de nitrate reductase est obtenu avec la souche témoin négatif, N. gonorrhoeae. soit la souche témoin négatif est pas N. gonorrhoeae ou la culture est contaminée par un organisme de nitrate positif. Vérifier la pureté et de l’identité de la souche de référence gonococcique. Répéter le test avec une culture pure d’une culture confirmée de N. gonorrhoeae .
      • La réaction de réduction du nitrate indique la capacité des organismes à réduire les nitrates, une réaction qui ne se produit que dans des conditions anaérobies; la réaction ne se produira pas si les organismes reçoivent une alimentation continue en oxygène. Ainsi, la réaction peut ne pas se produire dans des cultures fixes (en particulier les espèces de croissance lente), dans lequel le milieu est réparti en couches minces qui permettent à l’oxygène de se diffuser dans le milieu. Un test pour déterminer si l’oxygène est présent dans le milieu peut être faite en ajoutant une goutte de réactif oxydase dans le milieu. Si le milieu tourne au violet, le milieu contient de l’oxygène et la réaction de réduction des nitrates peut ne pas se produire. Si le milieu reste incolore, le milieu ne contient pas d’oxygène et le test de réduction des nitrates peuvent se produire. Il a été noté que N. gonorrhoeae les cellules utilisent l’oxygène rapidement si suffisamment de cellules sont inoculées dans le milieu. Si réactif oxydase est ajouté après environ 1 à 2 heures d’incubation, le milieu restera clair. Parce que le réactif oxydase tue les gonocoques présents dans le milieu, le milieu devient progressivement violet, en commençant par la partie supérieure du tube, que l’oxygène diffuse dans le milieu. Si le milieu est distribué dans des tubes de dimensions différentes de celles proposées ci-dessus, en sorte que le rapport surface à la profondeur est au moins égale ou inférieure à celles proposées ci-dessus. Si le diamètre du tube dans lequel le fluide est distribué est plus grande que celle décrite ci-dessus, utiliser un plus grand volume de milieu pour maintenir le même rapport entre la superficie à la profondeur.

      La réaction de réduction du nitrate ne peut pas se produire si le milieu dans lequel le test est réalisé ne permet pas la croissance normale de l’organisme. Cependant, le test peut être effectué dans un milieu qui ne supporte pas la croissance des organismes si l’inoculum est suffisamment dense que les enzymes préformées peuvent épuiser l’alimentation en oxygène existante et réduire les nitrates à un taux plus rapide que celle à laquelle l’oxygène se diffuse dans la moyen.

      Remarque: Pour vérifier que l’oxygène a été enlevé du milieu, ajouter 2 à 3 gouttes de réactif oxydase à un double du milieu ensemencé. Si l’oxygène a été adéquatement éliminée du milieu, le réactif oxydase ne tourne pas immédiatement violet. Si le milieu contient de l’oxygène dissous, le réactif oxydase tournera violet. On notera également que le test de réduction des nitrates peut être réalisée dans un milieu auquel le réactif oxydase a été ajoutée.
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    • Lorsque le réactif A est ajouté au milieu d’essai, le nitrite produit par suite de la réduction du nitrate formera un complexe avec l’acide sulfanilique, qui produit un précipité rouge avec l’alpha-naphtylamine dans le réactif B. La présence d’une couleur rouge dans la milieu d’essai indique que le nitrite est présent en raison de la réduction des nitrates. Toutefois, l’absence d’une couleur rouge après l’addition des réactifs A et B ne signifie pas nécessairement que le nitrate n’a pas été réduite. L’incapacité à développer une couleur rouge peut signifier (1), que le nitrate n’a pas été réduit, ou (2) que le nitrite produit par suite de la réduction du nitrate, a lui-même été réduite à gaz azoté. Pour déterminer si le nitrite a été réduit, placer une petite quantité de poudre de zinc dans le mélange d’incubation si elle est incolore après l’addition des réactifs A et B. La poudre de zinc catalyse la réduction du nitrate en nitrite; une couleur rouge devrait se développer dans le milieu qui contient encore du nitrate non réduit. Il est important, cependant, de ne pas ajouter trop de poussière de zinc; la poussière de zinc en excès va catalyser la réduction du nitrite produite à partir de ce que le nitrate, résultant dans un milieu incolore et l’interprétation incorrecte du test comme positif (un résultat faussement positif).
    • Un test nitrate réductase positif est obtenu avec la souche témoin négatif, N. gonorrhoeae. après l’addition de la poudre de zinc indique que le nitrate est réduit au-delà du nitrite, probablement en raison de l’ajout d’une trop grande poussière de zinc à l’épreuve. Répétez le test en veillant à ajouter très peu de poussière de zinc. La couleur rose, ce qui indique que l’organisme n’a pas réduit le nitrate, peut prendre 10 à 15 min. développer. Ne pas ajouter plus de poussière de zinc! Attendez que la couleur se développer. Si aucune couleur est développée en 30 min. interpréter le test comme positif.
    • Limites de test

      Si le test est effectué correctement et les souches de contrôle de qualité donnent des résultats appropriés, il devrait y avoir pas de limites à ce test. Des précautions doivent être prises pour veiller à ce que tous les composants de l’essai sont effectués correctement.

      Aucune identification de genre ou d’une espèce peut être faite sur la base du seul test de réduction des nitrates.

      Résultats, interprétation et rapports

      Les isolats peuvent être déclarés comme Nitrate positif si le nitrite (couleur rose) est détectée dans le milieu inoculé après l’addition des réactifs A et B ou si aucune couleur est détectée dans le milieu après l’addition de poussière de zinc.

      Les isolats peuvent être déclarés comme Nitrate négatif si le nitrite n’a pas été détecté (pas de changement de couleur) après l’addition des réactifs A et B, ou si une couleur rose se développe après l’addition de poudre de zinc dans le milieu inoculé.

      Bibliographie

      JS Knapp, Clark VL. la croissance anaérobie de Neisseria gonorrhoeae couplé à la réduction de nitrite. Infect Immun 1984; 46: 176-181.

      Skerman VBD. 1967. p.218 – 220. Un guide pour l’identification des genres de bactéries. Williams & Wilkins Co. Baltimore, MD.

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